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标准编号 | GB 4789.40-2024 (GB4789.40-2024) | 中文名称 | 食品安全国家标准--食品微生物学检验--克罗诺杆菌检验 | 英文名称 | National Food Safety Standards--Food Microbiological Testing--Cronobacter Testing | 行业 | 国家标准 | 字数估计 | 16,191 | 发布日期 | 2024/2/8 |
GB 4789.40-2024中文版:食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验
GB 4789.40-2024英文版:National Food Safety Standards--Food Microbiological Testing--Cronobacter Testing
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验
2024-02-08发布
2024-08-08实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会
国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB 4789.40-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠
杆菌)检验》。
本标准与GB 4789.40-2016相比,主要变化如下:
---修改了标准名称;
---标准适用范围增加了婴幼儿辅助食品;
---增加了PCR鉴定方法作为选做内容;
---删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中的产黄色素和苦杏仁苷项目;
---修改了培养基和试剂pH调节方法;
---修改了预热、选择性增菌温度以及TSA平板的培养温度和时间;
---修改了生化反应的培养温度及氨基酸培养基的制备。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 克罗诺杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中克罗诺杆菌(Cronobacterspp.)的检验方法。
本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下。
2.1 恒温培养箱:36℃±1℃,41.5℃±1℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃,-20℃。
2.3 恒温水浴箱:41.5℃±1℃。
2.4 天平:感量0.1g、0.01g。
2.5 振荡器。
2.6 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.7 无菌容器:容量100mL、200mL、2000mL。
2.8 无菌培养皿:直径90mm。
2.9 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.10 微生物生化鉴定系统。
2.11 PCR仪。
2.12 离心机:转速≥12000r/min。
2.13 凝胶成像系统或紫外检测仪。
2.14 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪。
2.15 PCR反应管。
2.16 1.5mL离心管。
2.17 10μL接种环。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(bufferedpeptonewater,BPW):见A.1。
3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium,mLST-Vm):见A.2。
3.3 克罗诺杆菌显色培养基。
3.4 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar,TSA):见A.3。
3.5 生化鉴定试剂盒。
3.6 氧化酶试剂:见A.4。
3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基:见A.5。
3.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见A.6。
3.9 L-精氨酸双水解酶培养基:见A.7。
3.10 糖类发酵培养基:见A.8。
3.11 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.9。
3.12 内转录间隔区(its)PCR引物见表1,基因扩增靶标参考序列见附录B。
3.13 5U/μL耐热DNA聚合酶。
3.14 2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
3.15 25mmol/LMgCl2。
3.16 10×PCR缓冲液:见A.10。
3.17 克罗诺杆菌质控菌株:具有菌种保藏资质单位提供的ATCC29544或等效菌株。
3.18 大肠埃希氏菌质控菌株:具有菌种保藏资质单位提供的ATCC25922或等效菌株。
3.19 DNA提取试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒。
3.20 商品化PCR反应预混液。
3.21 标准(高熔点)琼脂糖:分析纯。
3.22 核酸染色剂。
3.23 分子质量标准:100bpDNAladder。
3.24 50×TAE电泳缓冲液:见A.11。
3.25 6×DNA加样缓冲液:见A.12。
第一法 克罗诺杆菌定性检验
4 检验程序
克罗诺杆菌检验程序见图1。
图1 克罗诺杆菌检验程序
5 操作步骤
5.1 前增菌和选择性增菌
取检样100g(mL)置于无菌容器中,加入900mL已预热至41℃±1℃的BPW,用手缓缓地摇动
至检样充分溶解后,36℃±1℃培养18h±2h。轻轻摇动混匀培养过的前增菌液,移取1mL转入10mL
mLST-Vm肉汤中,41.5℃±1℃培养24h±2h。
5.2 分离
5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物,使用10μL接种环各取1环增菌培养物,分别划线接种于2个
克罗诺杆菌显色培养基平板,36℃±1℃培养24h±2h,或按培养基要求条件培养。
5.2.2 可疑菌落按显色培养基要求进行判定,每个平板挑取至少5个可疑菌落(不足5个时挑取全部可
疑菌落),分别划线接种于TSA平板,36℃±1℃培养24h±2h。
5.3 PCR鉴定(选做)
PCR试验环境条件和过程控制参照GB/T 27403规定执行。
5.3.1 DNA模板制备
可采用热裂解法制备模板,从每个TSA平板上挑取2个~3个克罗诺杆菌可疑菌落至500μL灭
菌去离子水中,充分混匀后100℃加热10min,冰浴冷却至室温,12000r/min离心10min,取上清液
作为DNA模板用于PCR鉴定。若上清液不能及时分析则于-20℃保存备用(1周以内)。
注:也可用等效商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒或全自动核酸提取仪按操作要求提取DNA模板。
5.3.2 PCR扩增
5.3.2.1 引物
PCR鉴定用引物信息见表1。
5.3.2.2 PCR反应体系
PCR反应体系组成见表2。
5.3.2.3 反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃
延伸5min,4℃下保存。
5.3.3 对照设置
每次PCR鉴定时使用克罗诺杆菌标准菌株DNA模板作为阳性对照,大肠埃希氏菌标准菌株
DNA模板作为阴性对照,提取过程设置灭菌去离子水作为DNA提取空白对照,PCR反应需另设灭菌
去离子水作为PCR反应体系空白对照。
5.3.4 电泳
用1×TAE电泳缓冲液制备含核酸染色剂的1.5%琼脂糖电泳凝胶(核酸染色剂按照说明书要求
使用)。在电泳槽中加入电泳缓冲液,使液面没过胶面。将适量PCR扩增产物与6×加样缓冲液混合
后点样,其中第1孔加入100bpDNAladder。电压的设置根据公式---电泳槽正负极的距离(cm)×
5V/cm计算并设置,电泳时间为20min~30min。使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。
也可采用毛细管电泳仪等设备进行电泳。
5.3.5 PCR鉴定结果判定
质控系统:阴性对照和空白对照均未出现扩增条带,阳性对照出现预期大小(282bp,序列信息见附
录B)的扩增条带,则检测系统正常。任一种对照出现非上述正常结果,应重做试验,同时排除干扰
因素。
阳性结果:在质控系统正常的情况下,待测样品出现预期大小(282bp)的扩增条带,判定PCR结果
为阳性。
阴性结果:在质控系统正常的情况下,待测样品未出现预期大小(282bp)的扩增条带,判定PCR结
果为阴性。
5.4 确证试验
选做5.3时,自PCR结果阳性的TSA平板上挑取菌落进行生化鉴定,PCR结果阴性的TSA平板
不再进行生化鉴定。
未选做5.3时,直接将5.2.2的可疑菌落接种TSA平板后进行生化鉴定。可以首先鉴定克罗诺杆
菌显色培养基平板上最具特征性的菌落接种的TSA平板上的菌落。如果是阳性,则不需要测试其他
TSA平板上的菌落。如果是阴性,则选取其他TSA平板上的菌落进行鉴定,直到全部为阴性或发现阳
性菌落为止。为确保结果的准确性,对TSA平板上的菌落进行鉴定时,应使用新鲜的传代菌落。克罗
诺杆菌的主要生化特征见表3。上述鉴定也可选择商品化生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统
进行。
6 结果与报告
根据菌落特征、确证试验(生化鉴定)和/或PCR鉴定结果,报告100g(mL)样品中检出或未检出克
罗诺杆菌。
第二法 克罗诺杆菌定量检验
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
取检样100g(mL)、10g(mL)、1g(mL)各3份,分别置无菌容器中,分别加入900mL、90mL、
9mL已预热至41℃±1℃的BPW,用手缓缓地摇动至检样充分溶解,制成1∶10样品匀液,36℃±
1℃......
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