标准搜索结果: 'GB 4789.42-2016'
| 标准编号 | GB 4789.42-2016 (GB4789.42-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验 | | 英文名称 | Detection of norovirus in shellfish -- Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | X09 | | 字数估计 | 15,118 | | 发布日期 | 2016-12-23 | | 实施日期 | 2017-06-23 | | 旧标准 (被替代) | SN/T 1635-2005 | | 标准依据 | National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016 | | 发布机构 | 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局 | GB 4789.42-2016
Detection of norovirus in shellfish--Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 诺如病毒检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替SN/T 1635-2005《贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-
PCR方法》。
本标准与SN/T 1635-2005相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验”;
---标准检测范围从“贝类”扩增为“食品”;
---修改“操作步骤”;
---增加“质量控制要求”,可参见附录C;
---删除“普通RT-PCR方法”。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 诺如病毒检验
1 范围
本标准规定了食品中诺如病毒(Norovirus)的实时荧光RT-PCR检测方法。
本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等
食品中诺如病毒核酸的检测。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 实时荧光PCR仪。
2.2 冷冻离心机。
2.3 无菌刀片或等效均质器。
2.4 涡旋仪。
2.5 天平:感量为0.1g。
2.6 振荡器。
2.7 水浴锅。
2.8 离心机。
2.9 高压灭菌锅。
2.10 低温冰箱:-80℃。
2.11 微量移液器。
2.12 pH计或精密pH试纸。
2.13 网状过滤袋:400mL。
2.14 无菌棉拭子。
2.15 无菌贝类剥刀。
2.16 橡胶垫。
2.17 无菌剪刀。
2.18 无菌钳子。
2.19 无菌培养皿。
2.20 无RNase玻璃容器:见E.1.2。
2.21 无RNase离心管、无RNase移液器吸嘴、无RNase药匙、无RNasePCR薄壁管:见E.1.3。
3 试剂
除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无RNase超纯水:见E.2.1。
3.1 GⅠ、GⅡ基因型诺如病毒的引物、探针:见A.1。
3.2 过程控制病毒的引物、探针:见A.1。
3.3 过程控制病毒:制备见附录C。
3.4 外加扩增控制RNA:制备见附录D。
3.5 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGB E)缓冲液:见E.2.2。
3.6 5×PEG/NaCl溶液(500g/L聚乙二醇PEG8000,1.5mol/LNaCl):见E.2.3。
3.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4。
3.8 氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5。
3.9 蛋白酶K溶液:见E.2.6。
3.10 75%乙醇:见E.2.7。
3.11 Trizol试剂:见E.2.8。
4 检验程序
诺如病毒检验程序见图1。
图1 诺如病毒检验程序
5 操作步骤
5.1 病毒提取
注:样品处理一般应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将
样品保存在-80℃冰箱中,试验前解冻。样品处理和PCR反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可
设置2~3个平行处理。
5.1.1 软质水果和生食蔬菜
5.1.1.1 将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体
积,可不切)。
5.1.1.2 将样品小块移至带有400mL网状过滤袋的样品袋,加入40mLTGB E溶液(软质水果样品,
需加入30UA.niger果胶酶,或1140UA.aculeatus果胶酶),加入10μL过程控制病毒。
5.1.1.3 室温,60次/min,振荡20min。酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10min检测pH,如pH
低于9.0时,使用1mol/LNaOH调pH至9.5,每调整一次pH,延长振荡时间10min。
5.1.1.4 将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管。10000r/min,4℃,离心30min。
取上清至干净试管或三角瓶,用1mol/LHCl调pH至7.0。
5.1.1.5 加入0.25倍体积5×PEG/NaCl溶液,使终溶液浓度为100g/LPEG,0.3mol/LNaCl。60s
摇匀,4℃,60次/min,振荡60min。10000r/min,4℃,离心30min,弃上清。10000r/min,4℃,离
心5min紧实沉淀,弃上清。
5.1.1.6 500μLPBS悬浮沉淀。如食品样品为生食蔬菜,可直接将悬浮液转移至干净试管,测定并记
录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中。加入
500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5min。10000r/min,4℃,离心15min,将液相部分仔
细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。
5.1.2 硬质表面食品
5.1.2.1 将无菌棉拭子使用PBS湿润后,用力擦拭食品表面(< 100cm2)。记录擦拭面积。将10μL
过程控制病毒添加至该棉拭子。
5.1.2.2 将棉拭子浸入含490μLPBS试管中,紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3~4次,
确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续RNA提取。硬质食品表面过于粗糙,可
能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子。
5.1.3 贝类
5.1.3.1 戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类。
5.1.3.2 使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培
养皿中。收集2.0g。
5.1.3.3 使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管。加入10μL过程控制病毒。加
入2.0mL蛋白酶K溶液,混匀。
5.1.3.4 使用恒温摇床或等效装置,37℃,320次/min,振荡60min。
5.1.3.5 将试管放入水浴或等效装置,60℃,15min。室温,3000r/min,5min离心,将上清液转移至
干净试管,测定并记录上清液mL数,用于后续RNA提取。
5.2 病毒RNA提取和纯化
注:病毒RNA可手工提取和纯化,也可使用商品化病毒RNA提取纯化试剂盒。提取完成后,为延长RNA保存时
间可选择性加入RNase抑制剂。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。提取出来的RNA立
即进行反应,或保存在4℃小于8h。如果长期储存建议-80℃保存。
5.2.1 病毒裂解
将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积Trizol试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5min,加入
0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/min,离
心5min,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层。
5.2.2 病毒RNA提取
离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5min,12000r/min,离心5min,弃上清,倒置于
吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。
5.2.3 病毒RNA纯化
5.2.3.1 每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤RNA沉淀2次。
5.2.3.2 于4℃,12000r/min,离心10min,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸
水纸不同地方沾干)。或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰
到有沉淀,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶。
5.2.3.3 加入16μL无RNase超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min,离心5s,冰上保存
备用。
5.3 质量控制
5.3.1 空白对照
以无RNase超纯水作为空白对照(A反应孔)。
5.3.2 阴性对照
以不含有诺如病毒的贝类,提取RNA,作为阴性对照(B反应孔)。
5.3.3 阳性对照
以外加扩增控制RNA,作为阳性对照(J反应孔)。
5.3.4 过程控制病毒
5.3.4.1 以食品中过程控制病毒RNA的提取效率表示食品中诺如病毒RNA的提取效率,作为病毒提
取过程控制。
5.3.4.2 将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化RNA。可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的
RNA量,-80℃保存,每次检测时取出使用。
5.3.4.3 将10μL过程控制病毒的RNA进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒
引物、探针,采用与诺如病毒实时荧光RT-PCR反应相同的反应条件确定未稀释和梯度稀释过程病毒
RNA的Ct值。
5.3.4.4 以未稀释和梯度稀释过程控制病毒RNA的浓度lg值为X 轴,以其Ct值为Y 轴,建立标准曲
线;标准曲线r2 应≥0.98。未稀释过程控制病毒RNA浓度为1,梯度稀释过程控制RNA浓度分别为
10-1、10-2、10-3等。
5.3.4.5 将含过程控制病毒食品样品RNA(C反应孔),加入过程控制病毒引物、探针,采用诺如病毒实
时荧光RT-PCR反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值,代入标准曲线,
计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度。
5.3.4.6 计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒 RNA 浓度×100%,即
(C反应孔)Ct值对应浓度×100%。
5.3.5 外加扩增控制
5.3.5.1 通过外加扩增控制RNA,计算扩增抑制指数,作为扩增控制。
5.3.5.2 外加扩增控制RNA分别加入含过程控制病毒食品样品RNA(H反应孔)、10-1稀释的含过程
控制病毒食品样品RNA(I反应孔)、无RNase超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附
录C反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值。
5.3.5.3 计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品RNA+外加扩增控制RNA)Ct值
-(无RNase超纯水+外加扩增控制RNA)Ct值,即抑制指数=(H反应孔)Ct值-(J反应孔)Ct值。
如抑制指数≥2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)Ct值-(J反应孔)
Ct值。
5.4 实时荧光RT-PCR
实时荧光RT-PCR反应体系和反应参数详见附录B。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不
同的反应总体积进行适当调整。可采用商业化实时荧光RT-PCR试剂盒。也可增加调整反应孔,实现
一次反应完成GⅠ和GⅡ型诺如病毒的独立检测。将18.5μL实时荧光RT-PCR反应体系添加至反应
孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测GⅠ或GⅡ基因型诺如病毒。
A反应孔:空白对照,加入5μL无RNase超纯水+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
B反应孔:阴性对照,加入5μL阴性提取对照RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μL过程控制病毒
引物探针;
D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5μL过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒引物探针;
E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5μL10-1倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒
引物探针;
F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5μL10-2倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒
引物探针;
G反应孔:病毒提取过程控制5,加入5μL10-3倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒
引物探针;
H反应孔:扩增控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1μL外加扩增控制 RNA+
1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
I反应孔:扩增控制2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+1μL外加扩增控
制 RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5μL无RNase超纯水+1μL外加扩增控制 RNA+1.5μL
GⅠ或GⅡ型引物探针;
K反应孔:样品1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
L反应孔:样品2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型
引物探针。
6 结果与报告
6.1 检测有效性判定
6.1.1 需满足以下质量控制要求,检测方有效:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳
性对照(J反应孔)阳性。
6.1.2 过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率≥1%;如提取效率< 1%,需重新检测;但如提取效率
< 1%,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性。
6.1.3 扩增控制(H~J反应孔)需满足:抑制指数< 2.00;如抑制指数≥2.00,需比较10倍稀释食品样
品的抑制指数;如10倍稀释食品样品扩增的抑制指数< 2.00,则扩增有效,且需采用10倍稀释食品样
品RNA的Ct值作为结果;10倍稀释食品样品扩增的抑制指数也≥2.00时,扩增可能无效,需要重新检
测;但如抑制指数≥2.00,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性。
6.2 结果判定
待测样品的Ct值大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;待测样品的Ct值小于等于38时,判定为
诺如病毒阳性;待测样品的Ct值大于38,小于45时,应重新检测;重新检测结果大于等于45时,判定
为诺如病毒阴性;小于等于38时,判定为诺如病毒阳性。
6.3 报告
根据检测结果,报告“检出诺如病毒基因”或“未检出诺如病毒基因”。
附 录 A
实时荧光RT-PCR引物和探针
GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时荧光RT-PCR引物和探针见表A.1。
表A.1 GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时荧光RT-PCR引物和探针
病毒
名称
序列
扩增产物
长度/bp
序列位置
诺如
病毒
GⅠ
QNIF4(上游引物):5’-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’;
NVGG1p(探针):5’-FAM-TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT-
TAMRA-3’
位于诺如病毒(GenBank登
录号 m87661)的 5291~
5376
诺如
病毒
GⅡ
QNIFs(探 针):5’-FAM-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-
TAMRA-3’
位于Lordsdale病毒(GenBank
登录号x86557)的5012~
5100
附 录 B
实时荧光RT-PCR的反应体系和参数
B.1 实时荧光RT-PCR反应体系见表B.1。
表B.1 实时荧光RT-PCR反应体系
名称 储存液浓度 终浓度
加样量/μL
GⅠ GⅡ 过程控制病毒
RT-PCR缓冲溶液 5× 1× 5 5 5
MgSO4 25mmol/L 1mmol/L 1 1 1
dNTPs 10mmol/L 0.2mmol/L 0.5 0.5 0.5
正义引物 50μmol/L 1μmol/L 0.5 0.5 0.5
反义引物 50μmol/L 1μmol/L 0.5 0.5 0.5
逆转录酶 5U/μL 0.1U/μL 0.5 0.5 0.5
DNA聚合酶 5U/μL 0.1U/μL 0.5 0.5 0.5
探针 5μmol/L 0.1μmol/L 0.5 0.5 0.5
RNA模板 ― ― 5 5 5
水(无RNase) ― ― 11 11 11
总体积 ― ― 25 25 25
B.2 实时荧光RT-PCR反应参数见表B.2。
表B.2 实时荧光RT-PCR反应参数
步骤 温度和时间 循环数
RT 55°,1h 1
预热 95℃,5min 1
扩增
变性 95℃,15s
退火延伸
60℃,1min
65℃,1min
附 录 C
过程控制病毒培养及引物、探针
C.1 概要
本标准使用过程控制病毒进行过程控制,可使用门哥病毒或其他等效,不与诺如病毒交叉反应的病
毒。门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒。门哥病毒株 MC0是一种重组病毒,与野生型门哥病毒
相比缺乏poly[C],是与野生型门哥病毒具有相似生长特性的无毒表型。门哥病毒株 MC0是一种转基
因生物,如果检测实验室不允许使用转基因生物,可以使用其他的过程控制病毒。也可使用商业化试剂
或试剂盒中的过程控制病毒。
C.2 培养试剂和仪器
C.2.1 HeLa细胞
L-谷氨酸和Earle’sBSS调为1.5g/L碳酸氢钠,0.1mmol/L非必需氨基酸,1.0mmol/L丙酮酸钠,
1×链霉素/青霉素液,100mL/L(生长)或20mL/L(维持)胎牛血清。
C.2.2 仪器
为确保细胞培养和病毒生长,需细胞培养所需的CO2 浓度可调培养箱,细菌培养耗材(例如培养
皿)等。
C.3 培养过程
门哥病毒培养在铺满80%~90%单层 HeLa(ATCCCCL-2TM)细胞中,置于50mL/LCO2 的气
氛中(开放培养箱)或不可调的气氛中(封闭培养箱),直至75%出现细胞病理效应。细胞培养器皿经过
一个冻融循环,将培养物3000r/min离心10min。将细胞培养物离心上清留存用于过程控制。
C.4 引物、探针
过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光RT-PCR的引物、探针见表C.1。采用其他等效的过程控制病
毒,需对应调整引物探针。
表C.1 过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光RT-PCR的引物、探针
病毒
名称
序列
扩增产物
长度/bp
序列位置
门哥
病毒
Mengo110(上游引物):5’-GCGGGTCCTGCCGAAAGT-3’
Mengo209(下游引物):5’-GAAGTA ACATATAGACAG ACG
CACAC-3’
BNFQ-3’
100
位于 门 哥 病 毒 缺 失 毒 株
MC0(详见附录D)的110~
209;相当于门哥病毒非缺失
毒株 M(GenBank 登 录 号
122089)的序列110~270
附 录 D
外加扩增控制RNA制备1)
D.1 概要
通过将目标DNA序列连接至合适的质粒载体上,目标序列位于RNA聚合酶启动子序列的下游序
列,从而表达出外部扩增控制 RNA。GⅠ型外部扩增 RNA 序列位于诺如病毒(GenBank登录号
m87661)的5291~5376。GⅡ型外部扩增RNA序列位于Lordsdale病毒(GenBank登录号x86557)的
5012~5100。
D.2 试剂和设备
D.2.1 限制性酶:用于连接及相关的缓冲液。
D.2.2 DNA纯化试剂。
D.2.3 体外RNA转录试剂(RNA聚合酶,NTPs,缓冲液等)。
D.2.4 RNase-freeDNase。
D.2.5 RNA纯化试剂。
D.2.6 DNA凝胶电泳试剂和设备。
D.2.7 培养箱:37℃。
D.3 质粒DNA连接
添加100ng~500ng纯化的目标DNA和质粒载体加入含有合适的限制酶和缓冲液的反应体系
中,限制酶和缓冲液的使用按照酶厂家推荐,并确保目标序列位于质粒中RNA聚合酶启动子序列的下
游。37℃培养120min。DNA纯化使用DNA纯化试剂纯化。使用凝胶电泳检查连接情况,比较连接
前与连接后目标DNA和质粒情况。
D.4 外加扩增控制RNA的表达
添加连接后的质粒至转化体系。该体系按照转化体系提供厂家建议配置。使用RNA纯化试剂纯
化RNA后,分装,-80℃储存,每次检测前取出备用。
1) 可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制RNA储备液,或者请生物公司代为制备。
附 录 E
RNase的去除和无RNase溶液的配制
E.1 RNase的去除
E.1.1 配制溶液用的酒精、异丙醇等应采用未开封的新品。配制溶液所用的超纯水、玻璃容器、移液器
吸嘴、药匙等用具应无RNase。操作过程中应自始自终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套,并经常更换,以避
免将皮肤上的细菌、真菌及人体自身分泌的RNase染用具或带入溶液。
E.1.2 玻璃容器应在240℃烘烤4h以去除RNase。
E.1.3 离心管、移液器吸嘴、药匙等塑料用具应用无RNase超纯水室温浸泡过夜,然后灭菌,烘干;或直
接购买无RNase的相应用具。
E.2 无RNase溶液的配制
E.2.1 无RNase超纯水
E.2.1.1 成分
超纯水 100mL
焦碳酸二乙酯(DEPC) 50μL
E.2.1.2 制法
室温过夜,121℃,15min灭菌,或直接购买无RNase超纯水。
E.2.2 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGB E)缓冲液
E.2.2.1 成分
甘氨酸 3.8g
牛肉膏 10g
无RNase超纯水 总体积1000mL
E.2.2.2 制法
将固体物质溶解于水,将总体积调整至1000mL,如果有必要,25℃调节pH至7.3。高压灭菌。
E.2.3 5×PEG/氯化钠溶液(500g/LPEG8000,1.5mol/L氯化钠)
E.2.3.1 成分
聚乙二醇(PEG)8000 500g
氯化钠 87g
无RNase超纯水 总体积1000mL
E.2.3.2 制法
将固体物质溶解在450mL的水中,如必要可缓慢加热。用水将体积调整至1000mL,混匀。高压
灭菌后备用。
E.2.4 磷酸盐缓冲液(PBS)
E.2.4.1 成分
氯化钠 8g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
无RNase超纯水 总体积1000mL
E.2.4.2 制法
将固体物质溶解于水,如果有......
|