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| 标准编号 | GB 5009.86-2016 (GB5009.86-2016) | | 中文名称 | 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定 | | 英文名称 | National Food Safety Standard -- Determination of Ascorbic Acid in Foods | | 行业 | 国家标准 | | 中标分类 | C53 | | 字数估计 | 11,153 | | 发布日期 | 2016-08-31 | | 实施日期 | 2017-03-01 | | 旧标准 (被替代) | GB/T 6195-1986; GB/T 5009.86-2003; GB/T 5009.159-2003 | | 标准依据 | 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第11号 | GB 5009.86-2016: 食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定
GB 5009.86-2016 英文名称: National Food Safety Standard -- Determination of Ascorbic Acid in Foods
中华人民共和国国家标准
1 范围
本标准规定了高效液相色谱法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法测定食品中抗坏血酸的方法。
本标准第一法适用于乳粉、谷物、蔬菜、水果及其制品、肉制品、维生素类补充剂、果冻、胶基糖果、八
宝粥、葡萄酒中的L(+)-抗坏血酸、D(+)-抗坏血酸和L(+)-抗坏血酸总量的测定。第二法适用于乳
粉、蔬菜、水果及其制品中L(+)-抗坏血酸总量的测定。第三法适用于水果、蔬菜及其制品中L(+)-抗坏血酸的测定。
5 仪器和设备
5.1 液相色谱仪:配有二极管阵列检测器或紫外检测器。
5.2 pH计:精度为0.01。
5.3 天平:感量为0.1g、1mg、0.01mg。
5.4 超声波清洗器。
5.5 离心机:转速≥4000r/min。
5.6 均质机。
5.7 滤膜:0.45μm水相膜。
5.8 振荡器。
6 分析步骤整个检测过程尽可能在避光条件下进行。
6.1 试样制备
6.1.1 液体或固体粉末样品:混合均匀后,应立即用于检测。
6.1.2 水果、蔬菜及其制品或其他固体样品:取100g左右样品加入等质量20g/L的偏磷酸溶液,经均
质机均质并混合均匀后,应立即测定。
6.2 试样溶液的制备
称取相对于样品约0.5g~2g(精确至0.001g)混合均匀的固体试样或匀浆试样,或吸取2mL~
10mL液体试样[使所取试样含L(+)-抗坏血酸约0.03mg~6mg]于50mL烧杯中,用20g/L的偏
磷酸溶液(4.2.2)将试样转移至50mL容量瓶中,震摇溶解并定容。摇匀,全部转移至50mL离心管
中,超声提取5min后,于4000r/min离心5min,取上清液过0.45μm水相滤膜,滤液待测[由此试液
可同时分别测定试样中L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的含量]。
6.3 试样溶液的还原
准确吸取20mL上述离心后的上清液于50mL离心管中,加入10mL40g/L的L-半胱氨酸溶液
(4.2.4),用100g/L磷酸三钠溶液调节pH至7.0~7.2,以200次/min振荡5min。再用磷酸调节pH
至2.5~2.8,用水将试液全部转移至50mL容量瓶中,并定容至刻度。混匀后取此试液过0.45μm水相
滤膜后待测[由此试液可测定试样中包括脱氢型的L(+)-抗坏血酸总量]。
若试样含有增稠剂,可准确吸取4mL经L-半胱氨酸溶液还原的试液,再准确加入1mL甲醇,混匀后过0.45μm滤膜后待测。
6.4 仪器参考条件
6.4.1 色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或同等性能的色谱柱。
6.4.2 检测器:二极管阵列检测器或紫外检测器。
6.4.3 流动相:A:6.8g磷酸二氢钾和0.91g十六烷基三甲基溴化铵,用水溶解并定容至1L(用磷酸调
pH至2.5~2.8);B:100%甲醇。按A∶B=98∶2混合,过0.45μm滤膜,超声脱气。
6.4.4 流速:0.7mL/min。
6.4.5 检测波长:245nm。
6.4.6 柱 温:25℃。
6.4.7 进样量:20μL。
6.5 标准曲线制作
分别对抗坏血酸混合标准系列工作溶液进行测定,以L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]标准溶
液的质量浓度(μg/mL)为横坐标,L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的峰高或峰面积为纵坐标,绘
制标准曲线或计算回归方程。L(+)-抗坏血酸、D(+)-抗坏血酸标准色谱图参见附录A中图A.1。
6.6 试样溶液的测定
对试样溶液进行测定,根据标准曲线得到测定液中L(+)-抗坏血酸[或D(+)-抗坏血酸]的浓度(μg/mL)。
6.7 空白试验
空白试验系指除不加试样外,采用完全相同的分析步骤、试剂和用量,进行平行操作。
8 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
9 其他固体样品取样量为2g时,L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出限均为0.5mg/100g,定量限
均为2.0mg/100g。液体样品取样量为10g(或10mL)时,L(+)-抗坏血酸和D(+)-抗坏血酸的检出
限均为0.1mg/100g(或0.1mg/100mL),定量限均为0.4mg/100g(或0.4mg/100mL)。第二法 荧光法
10 原理试样中L(+)-抗坏血酸经活性炭氧化为L(+)-脱氢抗坏血酸后,与邻苯二胺(OPDA)反应生成有
荧光的喹唔啉(quinoxaline),其荧光强度与L(+)-抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比,以此测定试
样中L(+)-抗坏血酸总量。
注:L(+)-脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除试样中荧光杂质产生的干扰。
11 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的三级水。
11.1 试剂
11.1.1 偏磷酸(HPO3)n:含量(以HPO3 计)≥38%。
11.1.2 冰乙酸(CH3COOH):浓度约为30%。
11.1.3 硫酸(H2SO4):浓度约为98%。
11.1.4 乙酸钠(CH3COONa)。
11.1.5 硼酸(H3BO3)。
11.1.6 邻苯二胺(C6H8N2)。
11.1.7 百里酚蓝(C27H30O5S)。
11.1.8 活性炭粉。
11.2 试剂的配制
11.2.1 偏磷酸-乙酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水,加温,搅拌,使之逐渐溶
解,冷却后加水至500mL。于4℃冰箱可保存7d~10d。
11.2.2 硫酸溶液(0.15mol/L):取8.3mL硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1000mL。
11.2.3 偏磷酸-乙酸-硫酸溶液:称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸,滴加0.15mol/L硫酸溶液至溶解,并稀释至500mL。
11.2.4 乙酸钠溶液(500g/L):称取500g乙酸钠,加水至1000mL。
11.2.5 硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸,用500g/L乙酸钠溶液溶解并稀释至100mL。临用时配制。
11.2.6 邻苯二胺溶液(200mg/L):称取20mg邻苯二胺,用水溶解并稀释至100mL,临用时配制。
11.2.7 酸性活性炭:称取约200g活性炭粉(75μm~177μm),加入1L盐酸(1+9),加热回流1h~2h,
过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110℃~120℃烘箱中干燥10h,备用。
检验铁离子方法:利用普鲁士蓝反应。将20g/L亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合,将上述洗出滤
液滴入,如有铁离子则产生蓝色沉淀。
11.2.8 百里酚蓝指示剂溶液(0.4mg/mL):称取0.1g百里酚蓝,加入0.02mol/L氢氧化钠溶液约
10.75mL,在玻璃研钵中研磨至溶解,用水稀释至250mL。(变色范围:pH等于1.2时呈红色;pH等
于2.8时呈黄色;pH大于4时呈蓝色)。
11.3 标准品
L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度≥99%。
11.4 标准品的配制
11.4.1 L(+)-抗坏血酸标准溶液(1.000mg/mL):称取L(+)-抗坏血酸0.05g(精确至0.01mg),用
偏磷酸-乙酸溶液溶解并稀释至50mL,该贮备液在2℃~8℃避光条件下可保存一周。
11.4.2 L(+)-抗坏血酸标准工作液(100.0μg/mL):准确吸取L(+)-抗坏血酸标准液10mL,用偏磷
酸-乙酸溶液稀释至100mL,临用时配制。
12 仪器和设备荧光分光光度计:具有激发波长338nm及发射波长420nm。配有1cm比色皿。
13 分析步骤整个检测过程应在避光条件下进行。
13.1 试液的制备称取约100g(精确至0.1g)试样,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入捣碎机内打成匀浆,用百里酚蓝
指示剂测试匀浆的酸碱度。如呈红色,即称取适量匀浆用偏磷酸-乙酸溶液稀释;若呈黄色或蓝色,则称
取适量匀浆用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH为1.2。匀浆的取用量根据试样中抗坏血酸的含量
而定。当试样液中抗坏血酸含量在40μg/mL~100μg/mL之间,一般称取20g(精确至0.01g)匀浆,
用相应溶液稀释至100mL,过滤,滤液备用。
13.2 测定
13.2.1 氧化处理:分别准确吸取50mL试样滤液及抗坏血酸标准工作液于200mL具塞锥形瓶中,加
入2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即为试样氧化液和标准氧化液,待测定。
13.2.2 分别准确吸取10mL试样氧化液于两个100mL容量瓶中,作为“试样液”和“试样空白液”。
13.2.3 分别准确吸取10mL标准氧化液于两个100mL容量瓶中,作为“标准液”和“标准空白液”。
13.2.4 于“试样空白液”和“标准空白液”中各加5mL硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至
100mL,在4℃冰箱中放置2h~3h,取出待测。
13.2.5 于“试样液”和“标准液”中各加5mL的500g/L乙酸钠溶液,用水稀释至100mL,待测。
13.3 标准曲线的制备
准确吸取上述“标准液”[L(+)-抗坏血酸含量10μg/mL]0.5mL,1.0mL,1.5mL,2.0mL,分别置
于10mL具塞刻度试管中,用水补充至2.0mL。另准确吸取“标准空白液”2mL于10mL带盖刻度试
管中。在暗室迅速向各管中加入5mL邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35min,于激发波长
338nm、发射波长420nm处测定荧光强度。以“标准液”系列荧光强度分别减去“标准空白液”荧光强
度的差值为纵坐标,对应的L(+)-抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或计算直线回归方程。
13.4 试样测定
分别准确吸取2mL“试样液”和“试样空白液”于10mL具塞刻度试管中,在暗室迅速向各管中加
入5mL邻苯二胺溶液,振摇混合,在室温下反应35min,于激发波长338nm、发射波长420nm处测定
荧光强度。以“试样液”荧光强度减去“试样空白液”的荧光强度的差值于标准曲线上查得或回归方程计
算测定试样溶液中L(+)-抗坏血酸总量。
15 精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
16 其他当样品取样量为10g时,L(+)-抗坏血酸总量的检出限为0.044mg/100g,定量限为0.7mg/100g。
第三法 2,6-二氯靛酚滴定法
17 原理
用蓝色的碱性染料2,6-二氯靛酚标准溶液对含L(+)-抗坏血酸的试样酸性浸出液进行氧化还原
滴定,2,6-二氯靛酚被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的2,6-二氯靛酚在酸性介质中显浅红色,由
2,6-二氯靛酚的消耗量计算样品中L(+)-抗坏血酸的含量。
18 试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的三级水。
18.1 试剂
18.1.1 偏磷酸(HPO3)n:含量(以HPO3 计)≥38%。
18.1.2 草酸(C2H2O4)。
18.1.3 碳酸氢钠(NaHCO3)。
18.1.4 2,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐,C12H6Cl2NNaO2)。
18.2 试剂的配制
18.2.1 偏磷酸溶液(20g/L):称取20g偏磷酸,用水溶解并定容至1L。
18.2.2 草酸溶液(20g/L):称取20g草酸,用水溶解并定容至1L。
18.2.3 2,6-二氯靛酚(2,6-二氯靛酚钠盐)溶液:称取碳酸氢钠52mg溶解在200mL热蒸馏水中,然
后称取2,6-二氯靛酚50mg溶解在上述碳酸氢钠溶液中。冷却并用水定容至250mL,过滤至棕色瓶
内,于4℃~8℃环境中保存。每次使用前,用标准抗坏血酸溶液标定其滴定度。
标定方法:准确吸取1mL抗坏血酸标准溶液于50mL锥形瓶中,加入10mL偏磷酸溶液或草酸
溶液,摇匀,用2,6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色,保持15s不褪色为止。同时另取10mL偏磷酸溶液或
草酸溶液做空白试验。
18.3 标准品
L(+)-抗坏血酸标准品(C6H8O6):纯度≥99%。
18.4 标准溶液的配制
L(+)-抗坏血酸标准溶液(1.000mg/mL):称取100mg(精确至0.1mg)L(+)-抗坏血酸标准品,
溶于偏磷酸溶液或草酸溶液并定容至100mL。该贮备液......
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